表 1.HA标签亲和层析介质性能表

2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤。
平衡Buffer：10mM Tris,0.15M NaCl, pH7.4
洗杂 Buffer: 10mM Tris,0.15M NaCl, 0.05% Tween-20,pH7.4
化学洗脱液: 0.1M glycine HCl, pH2.0-2.8，3M NaSCN 或者 50mM NaOH
温和洗脱液：50mM Tris,0.15M NaCl, 100-500ug HA 多肽/ml ，pH7.4  
中和液：1M Tris-HCl，pH8.5
 

溶液	优点	缺点
0.1M glycine HCl, pH2.0-2.8	如果目的蛋白在低 pH 下稳定，不会破坏填料结合能力	洗脱效率低 蛋白可能变性
3M NaSCN	洗脱效率高，不会破坏填料结合能力	蛋白可能变性
50mM NaOH	洗脱效率高	蛋白可能变性 减少填料使用寿命

 
2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和 pH 值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。 样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
 
2.3样品纯化
1. 将 Anti- HA Beads 装入合适的层析柱，层析用 5 倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。
2. 将样品加到平衡好的 Anti-HA Affinity Beads 中，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
3. 用 10-20 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4. A 化学洗脱：使用 5 倍柱体积的洗脱液，如果是甘氨酸溶液洗脱，收集管中预先加好中和液 10-20µl 中和液/ml 洗脱液，分管收集。
注：酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，Anti-HA Affinity Beads 在洗脱液中不要超过
20min。
B 温和洗脱：使用 5 倍柱体积的竞争性洗脱液 HA 多肽 1mg/ml 洗脱。30 度孵育
10-15min。重复 1-2 次。 
5. 使用 3 倍柱体积的洗脱液再生，然后用平衡液平衡至中性。
6. 然后保存在含有 0.05%叠氮化钠的 PBS 溶液中，2-8 度保存。 

2.4静态吸附
填料准备：取适量的 Anti-HA Affinity Beads 加入层析柱中，流干保护液。加入 5 倍柱体积的平衡液清洗。
1.加入样品溶液，4 度或室温震荡孵育 30min(不能磁力搅拌)，确保填料与样品溶液充分混合。
2.孵育完毕后，将填料混合液离心（1000x g 离心 5min）或过滤收集填料。
3.将填料装入层析柱中，用平衡液清洗直至紫外稳定。
4.用洗脱液或竞争性洗脱液洗脱，参考 2.3 中 4。
5.填料再生和保存参考2.3 中 5和 6。

2.5免疫共沉淀操作流程
1.填料准备： 取 20-100µl 的 Anti-HA Affinity Beads 混合液加入到 2ml 离心管中， 5000Xg 离心 30 秒，吸弃上清。
2.填料加入 0.5ml 平衡液，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用），5000Xg 离心 30 秒，吸弃上清。重复一次。
3.加入 200-1000µl 样品裂解液到处理好的填料中，混合均匀，在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管， 促使样品和填料充分接触并吸附，室温至少 1 小时。5000Xg 离心 30 秒，吸取上清，留样检测。
4.洗杂：加入 0.5ml 的洗杂液，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，5000Xg 离心 30 秒。再重复三次。确保去除非特异性吸附。
5.样品洗脱：可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。
A:化学洗脱  加入 100µl 的洗脱液（0.1M glycine HCl, pH2.0-2.8，3M NaSCN 或者 50mM NaOH），悬浮填料，室温孵育 5min。5000Xg 离心 30 秒。小心取出上清，不要吸到填料，用中和液中和。洗脱样品放置 4 度，长时间放置-20 度保存。
B:温和洗脱  加入 100µl 竞争性洗脱液 HA 多肽洗脱液。30 度孵育 30min, 5000Xg 离心 30 秒。小心取出上清，不要吸到填料，重复洗脱 1-2 次。洗脱样品放置 4 度，长时间放置-20 度保存。 
C:SDS-PAGE Buffer 洗脱  样品缓冲液中含有β-巯基乙醇和 DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有 SDS 的样品缓冲液可以使 Anti-HA 抗体变性，洗脱后的 Anti-HA Affinity Beads 没办法重复使用。 每管中加入 20µl 2X 样品缓冲液，煮 3min。5000Xg 离心 30 秒，吸取上清 SDS-PAGE 电泳检测。
 
3. 问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
流穿中有目的蛋白	填料过载	减少上样体积或增加填料体积。
	结合时间太短	延长样品和填料的结合时间。
	标签未暴露	可以加入低浓度的变性剂，上样前透析。
	溶液中试剂不兼容	样品上样前进行透析。
洗脱组分中没有目的蛋白	目的蛋白不稳定	使用新配制的样品。 低温操作。 细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂。
	样品中无标签融合蛋白	纯化前Western检测是否有HA标签融合蛋白
	目的蛋白表达量太低	优化蛋白表达量。 增加上样量。 减少NaCl浓度。
背景太杂	非特异性吸附	减少上样量