1. 产品介绍
兔IgG高速层析介质（4FF）是以兔IgG为亲和配体，一步纯化原核表达系统产生的蛋白A融合产品。蛋白A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。本层析介质是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下进行纯化。具体性能见表1。

                                                                                                                                              表1. 兔IgG高速层析介质（4FF）产品性能

性能	指标
基质	高度交联的4%琼脂糖微球
配体	兔IgG
载量	>1mg 蛋白A/ml 介质
粒径 (μm)	45-165
最大流速	0.3 MPa, 3 bar
储存缓冲液	0.02%New type preservative N，1× PBS
储存温度	2-8℃

                             
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
Ø 平衡/洗杂 Buffer: 50mM Tris，0.15M NaCl, 0.05%Tween-20, pH 7.6
Ø 洗脱Buffer: 0.5MHAc,pH 3.0或0.1M甘氨酸, pH 3.0
Ø 中和液：1M Tris-HCl, pH8.5

2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗涤缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2. 纯化流程

2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
Ø 平衡/洗杂 Buffer: 50mM Tris，0.15M NaCl, 0.05%Tween-20, pH 7.6
Ø 洗脱Buffer: 0.5MHAc,pH 3.0或0.1M甘氨酸, pH 3.0
Ø 中和液：1M Tris-HCl, pH8.5

2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗涤缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.3 层析介质装填

2.3.1重力预装柱的装填
1. 取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2. 将兔IgG高速层析介质（4FF）混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。
3. 加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4. 装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。
5. 装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，2-8°C保存。

2.3.2中压层析柱的装填
兔IgG高速层析介质（4FF）被广泛应用于工业纯化，因此，涉及到各种中压色谱层析柱的填装，下面介绍填装层析柱的方法。
装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下：
V = 1.15πr²h
V：所需介质体积ml
1.15：压缩系数
r：柱管半径cm
h：装填高度cm
注意：所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。
1. 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm的去离子水。
2. 将介质悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3. 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4. 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液 压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到 一个很好的装填效果。（注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%）当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
5. 关闭泵，关闭层析柱出口。
6. 如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7. 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8. 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

2.4 样品纯化

2.4.1孵育法纯化
1. 根据纯化的样品量，取适量兔IgG高速层析介质（4FF）加入离心管中，1000 rpm离心1 min,吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
2. 向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm离心1 min,吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重 力流干平衡液；重复两次以上。
3. 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4°C振荡孵育2-4 h或者37°C孵育30 min-2h。
4. 孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
5. 用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。
6. 加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5 min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1/10的中和液进行中和。

2.4.2重力柱法纯化
1. 将装填好的兔IgG高速层析介质（4FF）重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。
2. 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
3. 用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4. 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得 到高纯度和高浓度的蛋白。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1/10的中和液进行中和。

2.4.3中压层析柱法纯化
兔IgG高速层析介质（4FF）装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。
1. 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
2. 用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
3. 使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
4. 利用泵或样品环上样。注：样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大 量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5. 用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。
6. 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1/10的中 和液进行中和。
 
介质洗脱结束后，用平衡液冲洗5-10柱体积，然后用纯水冲洗5-10个柱体积，再用0.02%叠氮化钠，1× PBS冲洗2个柱体积，置于2-8°C保存。

2.5 SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

3. 问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	筛板被堵塞	清洗或更换筛板
	层析介质被堵塞	裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22或0.45 pm）过滤，或者离心去除。
样品纯化过程中曲线不稳	样品或buffer中有气泡	去除样品或柱子中的气泡
		样品和buffer进行脱气
洗脱组分中没有目的蛋白	样品中蛋白浓度太低	延长接触时间或用层析介质孵育结合
回收率逐渐减低	上样量太多	减少上样量
	柱子太脏，载量降低	再生清洗或更换层析介质