Protein A Gravity Preloaded Column Kit AbPur rProtein A Kit

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GoodsCode: BDTL0001-K

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Product Informations

Product No. BDTL0001-K
Synonyms Protein A Gravity Preloaded Column Set
Product Name Protein A Gravity Preloaded Column Kit AbPur rProtein A Kit
Category 532
Instruction Manual /files/uploads/instructions/2024/202406/BDTL0001-K_蛋白A重力预装柱套装_说明书.pdf

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Product Details

1.产品介绍

本品是用于分离和纯化单克隆抗体的通用性亲和层析介质，主要性能见下表。蛋白A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG，但是不与狗lgG结合，不结合人lgM、lgD和IgA。蛋白A与蛋白G与不同来源及亚类的免疫球蛋白结合能力不一样（见附表）。天然蛋白A有五个IgG结合区域和一些未知功能的区域，重组蛋白A去除了与白蛋白及细胞表面结合位点，只含有五个IgG结合区域，减少了非特异性吸附。

蛋白A层析介质性能表

指标	性能
基质	4%琼脂糖微球
配体	重组蛋白A
载量	>40mg人lgG/ml介质
粒径 (μm)	45-165
最大流速	0.1 MPa, 1 bar
pH 稳定范围	3-12
储存缓冲液	20%乙醇 1×PBS
储存温度	2-8℃

纯化流程

2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45 μm滤膜过滤。

结合/洗杂Buffer：0.15M NaCl, 20 mM Na₂HPO₄, pH 7.0
洗脱Buffer：0.1M甘氨酸，pH 3.0
中和液：1M Tris-HCl，pH8.5

2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
2.3 重力柱的装填
1）取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2）将rprotein G Beads混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半) ,打开下出口流干保护液。
3）加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4）装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。
5）装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4℃保存。
2.4 样品纯化
2.4.1 孵育法纯化

根据纯化的样品量，取适量rProtein G Beads加入离心管中，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
加入样品，封闭离心管或重力柱管，4 ℃振荡孵育2-4 h或者37 ℃孵育30 min-2 h。
孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。
加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1 / 10的中和液进行中和。

2.4.2 重力柱法纯化

将蛋白G层析介质装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的平衡Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，重复2-3次，起到保护蛋白的作用。
将样品加到平衡好的层析介质中样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率（保证目的蛋白与层析介质充分接触，提高目的蛋白的回收率。
用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1 / 10的中和液进行中和。

注：上述步骤介质洗脱结束后，依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用20%的乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于4度保存，防止填料被细菌污染。
2.5 SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
3. 层析介质清洗
本品可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对层析介质进行清洗。

去除一些沉淀或变性物质

用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质

用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。

问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	筛板被堵塞	清洗或更换筛板
	层析介质被堵塞	按照第3部分进行层析介质清洗
	层析介质被堵塞	裂解液中含有微小的固体颗粒，建议过滤
样品纯化过程中曲线不稳	样品或buffer中有气泡	去除样品或柱子中的气泡
样品纯化过程中曲线不稳	样品或buffer中有气泡	样品和buffer进行脱气
洗脱组分中没有目的蛋白	样品中抗体浓度太低	使用其抗原做配体的介质
洗脱组分中没有目的蛋白	抗体被降解	适当的提高洗脱pH
回收率逐渐减低	上样量太多	减少上样量
回收率逐渐减低	柱子太脏，载量降低	按照第3部分进行层析介质清洗

5. 抗体纯化介质一览表

通用性抗体纯化产品
蛋白A层析介质（普通型、高载量、特异性优良）	BDTL0001-1			1ml
	BDTL0001-5			5ml
	BDTL0001-25			25ml
	BDTL0001-100			100ml
蛋白A重力预装柱套装（内含1支3ml重力预装柱，以及3次量的缓冲液）	BDTL0001-K			套
蛋白A高速层析介质（4FF）（高流速、高载量、特异性优良、耐压）	BDTL0002-5			5ml
	BDTL0002-25			25ml
	BDTL0002-100			100ml
蛋白A高速层析介质（4FF）预装柱（预装柱、高流速、高载量、配套BioRad和GE等公司机器）	BDTL0002-11			1×1ml
	BDTL0002-51			5×1ml
	BDTL0002-15			1×5ml
	BDTL0002-55			5×5ml
	BDTL0002-3115			3×1ml+1×5ml
蛋白G层析介质（普通型、高载量、特异性优良）	BDTL0003-1			1ml
	BDTL0003-5			5ml
	BDTL0003-25			25ml
	BDTL0003-100			100ml
蛋白G重力预装柱套装（内含1支3ml重力预装柱，以及3次量的缓冲液）	BDTL0003-K			套
蛋白G高速层析介质（4FF）（高流速、高载量、特异性优良、耐压）	BDTL0004-5			5ml
	BDTL0004-25			25ml
	BDTL0004-100			100ml
蛋白G高速层析介质（4FF）预装柱（预装柱、高流速、高载量、配套BioRad和GE等公司机器）	BDTL0004-11			1×1ml
	BDTL0004-51			5×1ml
	BDTL0004-15			1×5ml
	BDTL0004-55			5×5ml
	BDTL0004-3115			3×1ml+1×5ml
蛋白A/G高速层析介质（4FF）（用于IP、Co-IP实验）	BDTL0021-5			5ml
	BDTL0021-25			25ml
	BDTL0021-200			200ml
蛋白L层析介质（结合更广泛来源及亚类的抗体）	BDTL0022-5			5ml
	BDTL0022-25			25ml
	BDTL0022-200			200ml
单克隆抗体纯化产品
蛋白A高速耐碱层析介质（4FF）（耐碱、高流速、高载量、特异性优良、耐压、高稳定性）	BDTL0005-10		10ml
	BDTL0005-100		100ml
	BDTL0005-500		500ml
蛋白A高速耐碱层析介质（4FF）预装柱（预装柱、耐碱、高流速、高载量、耐压、高稳定性、配套BioRad和GE等公司机器）	BDTL0005-11		1×1ml
	BDTL0005-51		5×1ml
	BDTL0005-15		1×5ml
	BDTL0005-55		5×5ml
	BDTL0005-3115		3×1ml+1×5ml
多克隆抗体纯化产品
预活化层析介质（抗原偶联专用）（预活化层析介质，可以和氨基、巯基反应，用来偶联蛋白、核酸、小分子等。适合偶联抗原纯化多克隆抗体）	BDTL0006-5	5ml
	BDTL0006-25	25ml
	BDTL0006-100	100ml
亲硫层析介质（快速从血清、腹水或组织培养液中纯化抗体）	BDTL0025-5	5ml
	BDTL0025-10	10ml
	BDTL0025-50	50ml
	BDTL0025-250	250ml

附表 Protein A和Protein G对不同抗体的结合能力

种属	亚型	Protein A 结合力	Protein G 结合力
Human	IgA	Variable	-
	IgD	-	-
	IgE	-	-
	IgG1	++++	++++
	IgG2	++++	++++
	IgG3	-	++++
	IgG4	++++	++++
	IgM	Variable	-
Avian egg yolk	IgY	-	-
Cow		++	++++
Dog		++	+
Goat		-	++
Guinea pig	IgG1	++++	++
Guinea pig	IgG2	++++	++
Hamster		+	++
Horse		++	++++
Koala		-	+
Liama		-	+
Monkey (rhesus)		++++	++++
Mouse	IgG1	+	++++
	IgG2a	++++	++++
	IgG2b	+++	+++
	IgG3	++	+++
	IgM	Variable	-
Pig		+++	+++
Rabbit	No distinction	++++	+++
Rat	IgG1	-	+
	IgG2a	-	++++
	IgG2b	-	++
	IgG3	+	++
Sheep		+/-	++

++++：结合能力强； ++：结合能力中等；-：结合能力弱或没有结合

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Product Q&A

查看更多产品问答

Q1: How many times can this product be reused? What is the protein recovery rate?

Q2: What is the maximum sample volume that can be added to the 3ml gravity pre-packed column set at one time?

Q3: What is the centrifugal force for the resin?

Q4: I didn't enrich antibodies in my purification. Can the flow-through, wash, and eluate be passed through the column again?

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